Guillaume Dufay war - nach seiner Ausbildung (Chorknabe 1409-12) in der Kathedrale von Cambrai - ab 1414 beim Konzil von Konstanz tätig, etwa von 1420 an stand er im Dienst der Familie Malatesta in Rimini und Pesaro. 1424 kehrte er nach Cambrai zurück. Zwei Jahre später trat er in Bologna in den Dienst des Kardinals Louis Aleman. 1428 wurde er dort zum Priester geweiht.



Von 1428 bis 1433 und von 1435 bis 1437 war er Mitglied der päpstlichen Kapelle in Rom bzw. Florenz. 1436 komponierte er eines seiner berühmtesten Werke, die Motette Nuper rosarum flores, die anlässlich der Weihe von Brunelleschis Kuppel des Doms zu Florenz (dort lebte Papst Eugen IV. im Exil) aufgeführt wurde. In dieser Zeit begann seine langwährende Verbindung zur Familie d’Este in Ferrara, die zu den bedeutendsten Förderern der Musik zählte. Er wirkte ab 1440 wieder in Cambrai, wo er gemeinsam mit Nicolas Grenon die gesamte Musikaliensammlung revidierte. Als Kanoniker war er auch in der Kathedralverwaltung tätig. Ab 1451/52 hielt er sich für sechs Jahre am Hof von Savoyen auf und lebte ab 1458 als geistlicher Würdenträger wieder in Cambrai. Dort blieb sein Lebensmittelpunkt, obwohl er mehrfach versuchte, im Süden eine gesicherte Anstellung zu finden. Nach kurzer Krankheit verstarb er in Cambrai im Alter von etwa 77 Jahren.



Seine etwa 200 erhaltenen Kompositionen umfassen geistliche und weltliche Werke: sieben vollständige Messen und Messsätze, drei Magnificats, 24 Hymnen und andere liturgische Werke, 19 lateinische Motetten geistlicher und weltlicher Art, eine Sammlung einstimmer Choräle und überdies über 80 Chansons in französischer und italienischer Sprache. Darüber hinaus mag einiges an anonymen Musikalien des 15. Jahrhunderts ihm zuzuschreiben sein.



Seine gesamte geistliche Musik ist vokal, obwohl es möglich ist, dass Instrumente zur Verstärkung der Gesangsstimmen eingesetzt wurden. Auch die Rondeaus, Balladen und andere Formen weltlicher Werke sind nie rein instrumental gesetzt.



Seine ersten vollständigen Messen, die Missa sine nomine und die Missa Sancti Jacobi, stammen aus der Zeit vor 1440 und zeigen erstmals die Verwendung des Fauxbourdon (den Dufay möglicherweise erfunden hat). Hier setzte er auch die Technik des Kopfmotivs ein, das die Messe (deren Teile bislang von verschiedenen Komponisten zu stammen pflegten) zu einem einheitlichen Ganzen zusammenfasst. Ab 1450 jedoch ließen Dufays Messen englischen Einfluss (besonders John Dunstables) erkennen: Cantus firmus und Isorhythmie. Dies leitete später zu kontrapunktischen Formen über.



Seine Motetten stammen sämtlich aus der Zeit vor 1450 und sind komplexe isorhythmische Motetten. Bei der erwähnten Motette Nuper rosarum flores entsprechen die Proportionen ihrer Teile den (unterstellten) Proportionen des Salomonischen Tempels – die Musik als geistliches Symbol.



Von vier Lamentationes anlässlich des Falles von Konstantinopel (1453) geschrieben, ist lediglich eine erhalten.



Dufay soll statt der früher üblichen schwarzen Noten die weißen eingeführt haben; auch andere Neuerungen in der Notation werden ihm (von Adam von Fulda) zugeschrieben.